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　　PPO，即多酚氧化酶，是典型的銅結合氧化酶。它在植物中以單體、二聚體和四聚體的結構存在，且存在幾種異構。

　　在大麥中，部分PPO以“潛伏”狀態存在。而在浸麥過程中，可以通過除去一些酶抑制劑、蛋白酶作用或其他一些方式，使其活性在浸麥過程中增長。

　　在大麥發芽的過程中，PPO活性提高，對麥芽質量產生了重要影響。

　　大麥中的多酚物質經過PPO的催化氧化后，具有單寧性質，易和蛋白質起交聯作用而沉淀出來，直接影響麥芽、麥汁的品質，進而影響啤酒的色澤、泡沫、風味和非生物穩定性。因此，研究PPO的酶學特性，不但能為選擇優質的啤酒大麥品種提供重要依據，而且對提高麥芽和啤酒質量具有重要的意義。

　　本文，筆者以鄰苯二酚為底物，通過分光光度計法，對國產大麥中多酚氧化酶（PPO）的酶學特性進行了研究，并同時建立了PPO活性測定方法，確定了大麥PPO的米氏常數Km為1.96mmol/L。

　　1.主要材料和儀器

　　1.1 主要材料：國產大麥

　　1.2 主要儀器：TS4－2型雙控雙溫糖化試驗器（北京發酵工業研究所），756MC型紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），HWS－250型智能恒溫恒濕培養箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠）。

　　2.方法

　　2.1 多酚氧化酶酶液的制備

　　稱取200g大麥，置于250mL燒杯中，用水沖洗3至4遍，然后加水置于培養箱中，將培養箱溫度設置為16℃，加水浸麥。在大麥水分約達到38%時，結束浸麥，進入發芽階段。培養24小時后，稱取10g濕麥芽，用去離子水反復沖洗5遍以上，置于研缽中搗碎，將搗碎的麥芽放入糖化杯內，加去離子水90mL，0.2mol/L、pH5.0的醋酸－醋酸鈉緩沖液10mL，于40℃恒溫水浴保溫攪拌1小時，然后過濾醪液，棄去最初的20mL濾液，保留最后得到的濾液，用以測定酶活力。

　　注意：在此操作過程中，所有容器均要求用去離子水沖洗至少3遍。

　　2.2 測定波長的選擇

　　取磷酸緩沖液2mL，加入0.2mol/L的鄰苯二酚溶液1.0mL、0.1mL，PPO濾液在室溫下迅速混合均勻，并置于比色杯中，然后在波長為385nm—475nm間測定吸光值。

　　2.3 PPO活力的測定

　　0.1mL酶液與0.1mol/L的鄰苯二酚（用pH7.6檸檬酸－磷酸緩沖液配制）溶液1.0mL，在80℃下反應3min，用2mL、20%的TCA終止反應，于415nm下用分光光度計測定吸光值。

　　酶活力單位定義：上述條件下，將每分鐘ΔA值增加0.01，定義為1個酶活力單位U（絕干）。

　　2.4 PPO的酶學性質

　　2.4.1 底物濃度與PPO活力的關系

　　在酶濃度一定時，配制濃度分別為2mmol/L、4mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L的鄰苯二酚溶液測定PPO活力。

　　2.4.2 酶濃度與PPO活力的關系

　　在底物濃度一定時，依次添加1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL的酶液，參照PPO活力的測定方法，測定PPO活力。

　　2.4.3 pH和溫度與PPO活力的關系

　　采用雙因素全面性實驗方法：用檸檬酸－磷酸緩沖液制備不同pH、不同溫度的鄰苯二酚溶液，pH值分別為6.4、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4，反應溫度為70℃、80℃、85℃、90℃，參照PPO活力的測定方法，檢測PPO活力。

　　2.4.4 酶催化反應時間的確定

　　參照PPO活力的測定方法，每30s測定一次吸光值，共測18次，可得到9min的PPO的酶促反應速率曲線。

　　2.4.5 PPO的熱穩定性

　　PPO在沸水中保溫2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min，水浴保溫至上述時間后，立即冷卻至室溫，測定PPO活力。

　　2.46 不同添加劑對PPO活力的影響

　　在反應體系中，分別加入不同濃度的檸檬酸、抗壞血酸，參照PPO活力的測定方法來測定PPO活力。[1] [2] [3]

    
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